研究院梁志梳博士后、李桂英教授、安太成教授和熊举坤副教授等人在国际期刊Chemosphere（IF2018= 5.108）发表了题为“Purification, molecular characterization and metabolic mechanism of an aerobic tetrabromobisphenol A dehalogenase, a key enzyme of halorespiration in Ochrobactrum sp. T”的学术论文。
论文摘要
由于环境污染物如四溴双酚A（TBBPA）等的生物降解作用因细菌而异，并且强烈依赖于这些细菌所表达的特定降解酶，因此为了更好的将这些细菌应用于环境污染物原位修复，非常有必要对其降解TBBPA的分子机理进行探索。在前期研究中，我们成功分离纯化出了一株具有同时高效脱溴和有氧矿化TBBPA能力的菌株Ochrobactrum sp. T, 但是到目前为止，对于TBBPA生物降解分子机理的研究还未见报道。本研究通过构建具有TBBPA降解能力的重组菌，并采用一系列纯化方法对TBBPA降解酶进行了分离纯化，并同时考察了该降解酶降解TBBPA的分子机理。结果表明，该降解酶（命名为溴酚脱卤素酶）的分子量为117 kDa，Km为26.6 μM，Vmax为0.133 μM min-1 mg-1。它是目前唯一一个被纯化出来具有TBBPA降解能力（去除率为78％）的脱卤素酶。电子供体NADPH或甲基紫精的加入可以提高脱卤酶的活性。而且重组菌与野生菌的粗酶液底物谱非常相似，表明该重组酶可能时负责TBBPA降解的关键酶。通过鉴定的3种中间产物，提出了脱卤酶在有氧条件下去除TBBPA的机理。这不仅有利于加深我们对TBBPA生物强化降解分子机制的认识，并且有助于环保相关部门开发出更有效修复被TBBPA污染的环境的策略。
主要内容
为了更有效的对TBBPA污染的环境进行生物修复，本研究的主要目的是从TBBPA的降解菌中分离和纯化出一个具有TBBPA脱溴能力的降解酶，并评估影响该脱卤素酶代谢活性的环境因素。通过对TBBPA降解酶的编码基因进行克隆和表达，获得了一株具有TBBPA降解功能的重组菌。经超声破壁和蛋白纯化树脂（Ni-NTA His-Bind resin）处理后，成功的对该脱卤酶进行了纯化，并借助超高效液相色谱系统与三重四极杆质谱联用仪对该脱卤酶降解TBBPA的中间产物进行了探究，提出了该酶降解TBBPA的机理。实验的主要流程见图1。
图1 TBBPA脱卤酶的分离纯化、鉴定和分子机理研究的示意图
通过研究不同亚细胞组分对TBBPA的去除效率（图2），发现重组菌的细胞悬浮液对6 mg L-1的TBBPA去除率为85%，而无细胞的提取液在240min内也可降解78% TBBPA，表明脱卤酶主要存在于细胞质中。
图2 不同亚细胞组分对TBBPA脱溴作用
Fig. 2. Debromination of TBBPA by different subcellular fractions of (a) recombinant strain and (b) wild strain T.
选择镍离子亲和层析对粗酶液进行分离纯化，发现经纯化后该脱卤酶被纯化了10.2倍数，比活力从0.3增加到了3.06，回收率为58.5%。从图3可以看出，该脱卤酶的大小为117 kDa，与卤代酸脱卤酶相似度达到了100%，是一种新型脱卤酶，我们将其命名为溴酚脱卤酶。
图3 TBBPA 脱卤酶的SDS-PAGE图
Fig. 3. SDS-PAGE analysis of the purified bromophenol dehalogenase from recombinant strain. Lane M: protein marker; Lane 1: protein extract of control strain E. coli pET30a (+); Lane 2: protein extract of recombinant strain; Lane 3: purified bromophenol dehalogenase.
从图4可以看出NADPH可以显著提高TBBPA脱卤酶的活性，这可能是因为NADPH可以为酶分解TBBPA的氧化呼吸链提供递氢体，此外，甲基紫精也可以加快脱卤酶分解TBBPA，表明甲基紫精也可以作为TBBPA脱卤反应的电子供体。脱卤酶具有很宽的底物谱，可以分解2,4,6-三溴苯酚（TBP），2,6-二溴苯酚（2,6-DBP），4-溴苯酚（4-BP）， 4-溴二苯醚和4,4-二溴二苯醚等一系列溴代化合物。这些酶学特性为脱卤酶在原位修复中的进一步应用提供了重要的依据。
图4 不同添加剂对溴酚脱卤酶的影响
Fig. 4. The effect of different additives on the activity of bromophenol dehalogenase from recombinant strain. The data is represented as the mean ± standard deviation for triplicate incubations.
对脱卤酶降解TBBPA的代谢中间产物进行分析发现，在最初的60 min，以4-丙烯基-2,6-二溴苯酚为主，随着反应的进行，TBP和4,4-二溴二苯醚的浓度逐渐的升高，到180 min，4,4-二溴二苯醚的浓度达到最大。随着反应时间从60 min 增加到 240 min，溴离子浓度也从16.7增加到37.7µM（图5）。根据上述的鉴定的中间产物，我们提出了脱溴酶降解TBBPA的机理为：在有氧的条件下，TBBPA首先被氧化形成了4-丙烯基-2,6-二溴苯酚和2,6-DBP，然后4-丙烯基-2,6-二溴苯酚被转化成TBP，随后在脱卤酶的作用下经4-BP迅速的转化成4,4-二溴二苯醚，最后脱溴生产二苯醚。
图5 TBBPA代谢中间产物生产浓度变化曲线
Fig. 5. Evolution curves of TBBPA biodegradation brominated intermediates by purified enzyme.
论文总结
通过构建具有TBBPA降解功能的重组菌，对TBBPA降解酶进行了纯化和鉴定并对其降解机理进行了考察。经过一系列的纯化步骤我们纯化了一个具有高效降解TBBPA的脱卤酶，这是目前唯一一个被纯化出来具有TBBPA降解能力（去除率为78％）的酶，我们将其命名为溴酚脱卤酶。当以TBBPA为底物时，Km为26.6 μM，Vmax为0.133 μM min-1 mg-1，NADPH和甲基紫精的加入可以加速TBBPA的降解，且该脱卤酶还可以同时降解包括2,6-DBP，4,4-二溴二苯醚，4-溴二苯醚等溴代底物。这将为今后典型溴代酚类阻燃剂的生物降解提供新的思路和依据。
论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2019.124461
